組織AMPK激酶活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)多肽底物受到AMPK 磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定產(chǎn)生 ADP過(guò)程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)，即采用比色法測(cè)定其氧化后吸光峰值的變化，以分析組織裂解樣品中 AMPK活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或完全純化酶樣品中AMPK激酶的定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。
5’AMP活化蛋白激酶（5’AMP activated protein kinase；AMPK）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其為從酵母到人體高度進(jìn)化保留的激酶復(fù)合物，由3個(gè)亞體，α、β、γ構(gòu)成：其中γ亞體有4個(gè)胱硫醚β合酶（cystathione beta synthase；CBS）結(jié)構(gòu)域，又稱為巴特曼（Bateman）結(jié)構(gòu)域，以探測(cè)AMP和ATP的比例；α亞體含有催化結(jié)構(gòu)域，一旦收到AMPKK或LKB1/MO25/STRAD 復(fù)合物催化的磷酸化后，AMPK被激活。所有亞體都有不同異構(gòu)體形式，包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2 和γ3。其功能在于保持細(xì)胞能量?jī)?nèi)環(huán)境恒定：促進(jìn)脂肪酸β氧化、抑制膽固醇合成、促進(jìn)肌肉葡萄糖吸收和調(diào)節(jié)胰島素分泌等。AMPK在肝臟、腦和肌肉組織中高度表達(dá)。其磷酸化目標(biāo)序列為 LKKLTRASFFGQ。基于底物L(fēng)KKLTRASFFGQ，在ATP的存在下，受到5’AMP活化蛋白激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析5’AMP活化蛋白激酶的活性。其反應(yīng)方式為：
11.放進(jìn)冰槽里孵育 30 分鐘，期間每 10 分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩 30 秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/div>
12.即刻放進(jìn) 4℃臺(tái)式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 10000g
13.小心移取上清液到新的無(wú)菌的 1.5 毫升離心管
14.移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－（GMS30030.1）
15.放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二、測(cè)定準(zhǔn)備
1.準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解懸液等），置于冰槽里
2.設(shè)定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù) 6次（共5分鐘），并置零
三、 背景對(duì)照測(cè)定
1.移取微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2.加入微升 酶促液（Reagent D）
3.加入微升 陰性液（Reagent G）
4.放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 2 分鐘
5.（選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零
6.（選擇步驟）取出比色皿
7.加入微升 反應(yīng)液（Reagent E）
8.加入微升 底物液（Reagent F）
9.上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3 秒之內(nèi)）
10．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340 波長(zhǎng)讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長(zhǎng)讀數(shù) 5 分鐘
四、 樣品測(cè)定
1.移取微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2.加入微升 酶促液（Reagent D）
3.加入 5 微升待測(cè)樣品（注意：50 微克細(xì)胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解）
4.放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 2 分鐘
5.（選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零
6.（選擇步驟）取出比色皿
7.加入微升 反應(yīng)液（Reagent E）
8.加入升 底物液（Reagent F）
9.上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3秒之內(nèi)）
10．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)：340 波長(zhǎng)讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長(zhǎng)讀數(shù) 5 分鐘
五、 計(jì)算樣品活性
單位＝微摩爾 NADH/分鐘六、酶標(biāo)板測(cè)定
1.在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
2.分別移取微升 緩沖液（Reagent C）到 96 孔板中
3.分別加入微升 酶促液（Reagent D）
4.分別加入 5 微升 陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（50 微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
5.輕輕搖動(dòng) 96 孔酶標(biāo)板
6.在 30℃溫度下孵育 2 分鐘
7.分別加入微升 反應(yīng)液（Reagent E）
8.分別加入微升 底物液（Reagent F）
9.輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
10.即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0 分鐘讀數(shù)和 5 分鐘讀數(shù)
11.活性計(jì)算：
單位＝微摩爾 NADH/分鐘七、抑制劑篩選
1.在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、完全活性和待測(cè)抑制劑樣品
2.按下表加入試劑
內(nèi)容物樣本背景完全酶活性待測(cè)抑制劑酶活性
緩沖液
（Reagent C）微升微升微升
陰性液
（Reagent G）微升————
待測(cè)抑制劑微升――微升
用戶自備的純化酶——微升（1 毫單位）微升（1 毫單位）
96 孔板每孔總量樣本背景孔
（ 微升）完全活性孔
（ 微升）待測(cè)抑制劑樣品孔
（ 微升）
3.輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板，混勻
4.放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 30 分鐘
5.分別加入微升 酶促液（Reagent D）
6.分別加入微升 反應(yīng)液（Reagent E）
7.分別加入微升 底物液（Reagent F）
8.輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
9.即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得初始吸光讀數(shù)（OD） 10．放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里孵育 30 分鐘11．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得終點(diǎn)吸光讀數(shù)（OD）
12．實(shí)際吸光讀數(shù)：初始吸光讀數(shù)（OD）—終點(diǎn)吸光讀數(shù)（OD）
13．抑制活性計(jì)算：
1)
2)IC50：50％抑制率所需的抑制劑濃度
3） 直接構(gòu)建抑制曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為吸光讀數(shù) OD；橫座標(biāo)（X 軸）為已知抑制劑濃度
注意事項(xiàng)
1.本產(chǎn)品為 25 次操作，包括背景操作
2.操作時(shí)，須戴手套
3.系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需 1 次
4.樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
5.樣品須澄清，至關(guān)重要
6.加入 底物液（Reagent F）后 3 秒內(nèi)即刻比色測(cè)定
7.測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù) 30 分鐘
8.比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
9.樣本測(cè)定 0 分鐘讀數(shù)高于 5 分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
10.建議待測(cè)樣本蛋白濃度為 50 微克/5 微升（本公司提供 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－
GMS30030.1）
11.如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
12.可以使用 AMPK 抑制劑（DORSOMORPHIN）作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
13．5’AMP 活化蛋白激酶活性單位濃度定義：在 30℃溫度下，pH 7.5 條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化 1 微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
14．本公司提供系列蛋白激酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感
組織AMPK 激酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒使用承諾
秉著“信譽(yù)至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后， 應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說(shuō)明書所述的使用效果。在貨到后 10 天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題，請(qǐng)立即以書面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告） 與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。
原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司
標(biāo)簽：組織AMPK激酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒 AMPK激酶活性試劑盒
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