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線粒體復合體Ⅴ試劑盒說明書

點擊次數：1196　日期：2016/10/24 9:02:16

線粒體復合體Ⅴ試劑盒說明書
 
分光光度法 25 管/24 樣
 
測定意義
 
線粒體復合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體中，由F1和F0兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產生的質子電化學梯度催化ATP合成，也可逆過程水解ATP。此外，復合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養菌和光合細菌中。復合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關鍵酶。
 
測定原理
 
復合體Ⅴ水解 ATP 產生 ADP 和 Pi，通過測定 Pi 增加速率來測定復合體Ⅴ活性。
 
需自備的儀器和用品
 
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
 
試劑一：25mL×1 瓶，-20℃保存；
 
試劑二：25mL×1 瓶，-20℃保存；
 
試劑三：1 mL×1 瓶，-20℃保存；
 
試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前每支加入 1.3mL 蒸餾水，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;試劑五：6mL×1 瓶，4℃保存；
 
試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 3mL 蒸餾水，充分混勻;試劑七：粉劑×1 瓶, 4℃保存；臨用前加入 10mL 蒸餾水，充分混勻;試劑八：粉劑×1 瓶, 4℃保存；臨用前加入 10mL 蒸餾水，充分混勻;試劑九：液體 10mL×1 瓶，室溫保存。
 
定磷試劑的配制：按 H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染（請根據需要，用多少配多少）。
 
注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
 
樣本的前處理：
 
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
 
1 準確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
 
2 將勻漿 600g，4℃離心 5min。
 
3 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心 10min。
 
4 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅴ（此步可選做）。
 
5 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入 800uL 試劑二和 8uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10 秒，重復 30 次），用于復合體Ⅴ酶活性測定。
測定步驟
 
1、酶促反應
 
試劑名稱（μL）
 
 
對照管
 
 
測定管
 
 
 
 
 
 
 
 
 
試劑四
 
 
50
 
 
50
 
 
 
 
 
 
 
 
 
試劑五
 
 
200
 
 
200
 
 
 
 
 
 
 
 
 
樣本
 
 
 
 
 
250
 
 
 
 
 
 
 
混勻， 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）準確水浴 30min
 
 
 
 
 
 
 
 
試劑六
 
 
100
 
 
100
 
 
 
 
 
 
 
 
 
樣本
 
 
250
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
混勻，4000g，室溫離心 10min，取上清液
 
 
2、定磷
 
 
 
 
 
 
 
上清液
 
250
 
 
250
 
定磷試劑
 
1250
 
 
1250
 
 
混勻，室溫靜置 10min 左右，在 660nm 處讀取 A 測定管和 A 對照管，計算ΔA=A 測定管-A對照管。
 
復合體Ⅴ活性計算
 
標準條件下測定的回歸方程為 y = 1.2487x + 0.0361；x 為標準品濃度（mmol/L），y 為 A 值。1、組織中復合體Ⅴ活性的計算:
 
（1） 按樣本蛋白濃度計算
 
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產生 1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。復合體Ⅴ活性（U/mg prot）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T =64× (ΔA-0.0361) ÷Cpr
 

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。（2） 按樣本鮮重計算
 
單位的定義：每 g 組織每分鐘產生 1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。
 
復合體Ⅴ活性（U/g 鮮重）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T =51.7× (ΔA-0.0361) ÷W
 

（3） 按細菌或細胞密度計算
 
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產生 1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。復合體Ⅴ活性（U/104 cell）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T
 
=0.103× (ΔA-0.0361)
 
V 反總：反應體系總體積，6×10-4 L； V 樣：加入樣本體積，0.25 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.808 mL；T：反應時

間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬。
 

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