乙酰輔酶 A( Acetyl-CoA)含量測定試劑盒說明書
分光光度法 25 管/24 樣
測定意義
乙酰輔酶 A 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中。是生物體能源物質代謝過程中產生的一種重要的中間代謝產物。在體內能源物質代謝中是一個樞紐性的物質。糖、脂肪、蛋白質三大營養物質通過乙酰輔酶 A 匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環和氧化磷酸化,經過這條通路徹底氧化生成二氧化碳和水,釋放能量用于 ATP 合成。此外,乙酰輔酶 A 是合成脂肪酸,酮體,膽固醇及其衍生物等生理活性物質的前體物質。
測定原理
蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和 NAD 生成草酰乙酸和 NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶 A 和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶 A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯反應,乙酰輔酶 A 含量和 NADH 的生成速率成正比,340nm 下吸光值的上升速率反應了乙酰輔酶 A 含量的高低。
需自備的儀器和用品
紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
試劑一:液體×1 瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1 支,-20℃保存。臨用前加入 250μL 試劑五充分溶解備用。試劑三:液體×1 支,4℃保存。臨用前加入 250μL 試劑五充分溶解備用。試劑四:粉劑×1 瓶,-20℃保存。臨用前加入 22.5μL 試劑五充分溶解備用。試劑五:液體×1 瓶,4℃保存。
工作液的配制:臨用前請根據擬用工作液體積(樣本數×0.92 m L),將試劑二、三和四按照 1:1:90 的比例混合,或者直接把試劑二和試劑三加入到試劑四中混勻(可以測定 24 樣);加樣前置 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)水浴鍋中預熱 30 min。
乙酰輔酶 A 的提取
1、細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104 個):試劑一體積(mL)為 500~1000:1 的
比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 試劑一),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次); 8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
2、組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟
1、分光光度計預熱 30min,用蒸餾水于 340nm 處調零。
2、取 920μL 工作液和 100μL 樣本至 1mL 石英比色皿,混勻,立即記錄 340nm 處 20s 的吸光值 A1 和 80s 時的吸光值 A2,計算ΔA=A2-A1。
3、乙酰輔酶 A 含量計算
標準條件下測定的回歸方程為 y = 1640x + 0.012;x 為吸光值,y 為標準品濃度(nmol/mL)。注意:本試劑盒最低檢測限為 1.6nmol/mL。
(1)按照蛋白濃度計算
乙酰輔酶A 含量(nmol/mg prot)=[(1640×ΔA+0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)=(1640×ΔA+0.012) ÷Cpr
需要另外測定,建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。(2)按照樣本質量計算
乙酰輔酶 A 含量(nmol/g 鮮重)=[(1640×ΔA+0.012) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(1640×ΔA+0.012)
÷W
(3 ) 按照細菌或細胞密度計算:
乙酰輔酶 A 含量(nmol/104)=[(1640×ΔA+0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)=(1640×ΔA+0.012)÷500 V1:加入反應體系中樣本體積,0.1mL;V2:
加入提取液體積,1 mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500 萬。