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點擊次數(shù):1417 日期:2016/1/13 12:07:31
自從McAb問世以來,放射免疫顯像和放射免疫治療研究才真正活躍起來。20多年來,人們研制出許多中McAb,相應(yīng)地進(jìn)行了很多RII和RIT的研究和嘗試,取得了很大成績,技術(shù)上有許多進(jìn)步,經(jīng)驗上有豐富的積累。但是也遇到了一些問題,主要有以下幾個方面。
一、人抗鼠抗體的產(chǎn)生
迄今人源化McAb雖然進(jìn)行了許多研究,但據(jù)臨床應(yīng)用還有較大距離。目前臨床應(yīng)用的基本上都是鼠源性的。它對人體是一種異種蛋白質(zhì),進(jìn)入人體后很可能引起人體對此異物的免疫應(yīng)答反應(yīng),特別是當(dāng)反復(fù)注射的更是如此,產(chǎn)生抗抗體,即人抗鼠抗體(human antimouse antibody,HAMA).標(biāo)記完整McAb,進(jìn)入機體后,約有50%的人立即產(chǎn)生HAMA。還有注射7-10天后出現(xiàn)HAMA。HAMA在體內(nèi)可維持半年至一年半。HAMA的產(chǎn)生不僅對病人造成不良作用,例如HAMA滴度高的病人,有可能引發(fā)III型變態(tài)反應(yīng),對第二次給藥造成困難,而且還影響靶組織對McAb的攝取量和McAb在體內(nèi)的分布于代謝。若血HAMA濃度<15%,對顯像影響不大,若>20%,則約有90%的標(biāo)記抗體與HAMA結(jié)合,形成免疫反應(yīng)復(fù)合物,隨后被機體消除。標(biāo)記抗體在血中半排期縮短,游離抗體濃度降低,減少了與靶細(xì)胞結(jié)合機會,從而使顯像困難。另外,所形成的面議反應(yīng)復(fù)合物被單核巨噬細(xì)胞吞噬后,還會引起肝、脾本底的增加,同樣葉穎賢顯像效果。目前避免或減輕HAMA反應(yīng)的措施主要有以下集中。
1、使用抗體片段 鼠源抗體恒定區(qū)是產(chǎn)生HAMA的主要免疫源,可誘發(fā)人體產(chǎn)生抗同種型抗體,這是HAMA的主要成分。抗體片段的免疫原性弱,但反復(fù)使用,也會產(chǎn)生抗獨特型抗體,它占HAMA的20%-80%,平均為40%。但是也有人認(rèn)為抗體片段基本上不誘導(dǎo)HAMA產(chǎn)生。總之,至少抗體片段產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)要小得多。
2、使用免疫抑制劑 在注射康提前,先用免疫抑制藥,以避免或減小免疫應(yīng)答反應(yīng)。
3、先注入同種型無關(guān)抗體 由于HAMA的主要成分是抗同種型抗體,在注射標(biāo)記抗體前,先注入同種型無關(guān)抗體結(jié)合HAMA,形成復(fù)合物,排出體外。
4、利用血漿清除術(shù) 本法可使接受放射免疫治療的病人HAMA滴度明顯降低。
5、研究和應(yīng)用基因工程抗體 利用基因工程制備注入單鏈抗體(single chain Fv fragment,sefv)、多價微型抗體、單區(qū)抗體、互補決定區(qū)、嵌合抗體、人源化抗體和人源抗體等,是McAb真正進(jìn)入臨床應(yīng)用的希望所在。
二、提高靶/非靶(T/NT)的放射性比值
RII是一個生物動態(tài)過程,受很多因素影響從而使本底升高,使T/NT比值降低。以腫瘤RII為例,由于腫瘤細(xì)胞表達(dá)的多數(shù)抗原既不是器官特異的,也不是腫瘤特異的,注入體內(nèi)的放射性僅有一小部分(約0.01%=0.001%)最終集中于腫瘤,而其余大部分則出現(xiàn)在血、肝、脾和腎等器官中,體積較小的和位于特殊臟器的腫瘤顯像受到限制。正常組織的高本底、當(dāng)用I標(biāo)記時,主要出現(xiàn)在血和胃;當(dāng)用In標(biāo)記時,主要出現(xiàn)在肝和脾等臟器。
為提高T/NT比值、增強圖像清晰度,提高探測率,過去的研究多立足于努力提高標(biāo)記抗體在腫瘤內(nèi)的濃聚、但收效不大。目前集中于降低本底放射性上,特別是In形成的肝臟和血中的本底放射性。以采取的方法有多種,例如相減技術(shù)、脂質(zhì)體第二抗體和標(biāo)記McAb片段等,但效果不甚顯著。
降低本底放射性研究的新進(jìn)展是預(yù)定位閃爍現(xiàn)象(pre-targeted scintigraphy)技術(shù)或預(yù)著靶免疫閃爍顯像(pretargeted immumno-scintigraphy)技術(shù)。其基本原理是:首先注射未經(jīng)放射性核素標(biāo)記的抗體,待其余腫瘤組織幾何且正常組織本地消退后,再注入放射性核素標(biāo)記的小分子化合物,它既能快速自血中清除,又能通過某種機制使抗體與小分子化合物在腫瘤部位幾何,從而提高T/NT比值,改善顯像。預(yù)定位技術(shù)有幾種,其中研究和應(yīng)永得最多的、效果也最好的是1987年引入的生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidin system,BAS).
1、生物素、親和素和鏈霉素親和素 生物素又稱維生素H或輔酶R,是小分子物質(zhì)、分子量為244、等電點PH為3.5,分子式為C10H16O3N2S.分子結(jié)構(gòu)中有咪唑酮環(huán)基,是與親和素(acidin,AV或鏈霉親合素(streptavidin,SA)上色氨酸殘基結(jié)合的主要部位。另一四氫噻吩環(huán)的C2上有一側(cè)鏈,其末端羧基是標(biāo)記抗體和酶的唯一結(jié)構(gòu)。每個IgG分子可以標(biāo)記數(shù)十個用化學(xué)方法活化的生物素分子,因此凡有生物素衍生物的反應(yīng)層就是一個放大級。
AV又稱抗生素蛋白或抗生素,其分子量約為66000,等電點PH約為10,是一種對生物素具有極高親和力和特異性的蛋白質(zhì)。而通常抗體與抗原間的親和實力約為。可見生物素與親和素間的親和力約為抗體與抗原間的親和力的1-100萬倍。因此生物素與親和素結(jié)合快速,而且復(fù)合物十分穩(wěn)定,在一般條件下極少解離。
SA是與AV具有相似的生物學(xué)特性的蛋白質(zhì),分子量為60000.完整的SA與AV一樣,由四條相同的含有128個氨基酸的肽鏈所組成。肽鏈之間由二硫鍵鏈接。每條肽鏈可結(jié)合一個生物素分子,因此一個SA與AV分子可結(jié)合四個生物素分子,從而具有生物放大作用。SA與AV一樣,與生物素具有極高的親和力,兩者對生物素的親和常數(shù)很接近。SA的活性以每毫克SA所結(jié)合的生物素的微克數(shù)表示,活性15ug/mg。SA對熱的耐受性較強。在4-42℃的培養(yǎng)液中二周時間,仍能保持活性。
雖然AV和SA在生物學(xué)特性、蛋白質(zhì)亞基組成幾何生物素能力等方面都相似,但兩者不完全相同。AV在體內(nèi)外的非特異性結(jié)合較高,這是因為AV的等電點為10,而SA的只為7:AV含含碳水化合物(甘露糖和乙酰葡糖胺)的量高達(dá)10%,這些糖類在體內(nèi)可與組織細(xì)胞上的糖受體相結(jié)合,而SA不含糖基。在體內(nèi)標(biāo)記SA血清除緩慢,而AV血清除較快,但卻易集聚于肝、腎等組織中。這種血清除快慢的差異,可能是因為它們的靜電荷不同。在生理PH下,AV呈強陽電荷,而SA則近中性。總之,SA在體內(nèi)的非特異結(jié)合較AV小,有人認(rèn)為SA偶和抗體更適合于二步法。
2、BAS系統(tǒng)預(yù)定位技術(shù)程序 BAS預(yù)定位技術(shù)程序,主要分為兩種,即二步法和三步法。
(1)二步法 二步法又分為兩種。第一種方法:靜脈注射AV或SA標(biāo)記的抗體,或稱AV或SA化的抗體。借助抗原和抗體的特異結(jié)合,一部分AV或SA化的抗體幾何于靶位置。經(jīng)過一定時間,待血中游離的AV或SA化抗體清除體外后,再注射放射核素標(biāo)記的生物素,借助生物素與AV或SA的高特異結(jié)合,放射性核素集合于靶位置。過一段時間后顯像。注射In-生物素后6個小時,即可或清晰顯像,本底很低。另外有人第一步不是注射AV化或SA化的抗體,而是先注射AV,經(jīng)過24小時候,再注射In標(biāo)記生物素后10分鐘到2小時,即可全身顯像
二步法的第二種方法:與第一種方法的注射次序相反。縣注射生物素標(biāo)記的抗體,或稱生速素化抗體,經(jīng)過2-3天,血中游離的生物素化抗體大量減少后,再局部注射放射性核素標(biāo)記的AV。注射部位主要是腹腔。由于SA等電點較AV低,且不含糖基,本底低,用SA代替AV可獲得更好效果、。有人對8為卵巢癌患者行RII,腹腔注射2mg生物素化抗體,3-5天后腹腔注射500ml In-SA生理鹽水,30分鐘后,即可顯像,癌/非癌組織放射性比值達(dá)17±11.
(2)三步法 三步法也分為兩種。第一種方法:先注射生物素抗體;24-48小時候,在注射過量的非標(biāo)記AV(或稱冷AV),本步目的在于快速清除血中抗體以及使結(jié)合與腫瘤的生物素化抗體結(jié)合上AV;最后注射放射性核素標(biāo)記的生物素,以便借助生物素和AV的高特異性結(jié)合,使放射性核素結(jié)合于腫瘤部位。前已續(xù)集AV由四個相同的亞基組成,每個亞基可以結(jié)合一個生物素分子,這樣可以多結(jié)合放射性核素,也就是有生物素放大作用。另外,本法也是建立在一下實驗基礎(chǔ)上的,在體內(nèi),McAb需24-48小時才能在腫瘤部位達(dá)到最大聚集,而此時血中的抗體還未完全清除;血中的AV化抗體復(fù)合物很快為肝臟攝取。本法在注射In標(biāo)記生物素3小時后,即可探測到腫瘤。
三步法的第二種方法:把A蛋白包被的瓊脂糖小珠植于體內(nèi):再注射AV化的抗體,借助A蛋白與抗體恒定區(qū)片段Fe的特異親和作用,把AV幾何于目標(biāo)靶。結(jié)果獲得良好的體內(nèi)定位效果。
3.BAS預(yù)定位技術(shù)的優(yōu)點①高靈敏度:生物素標(biāo)記抗體,不僅對抗體活性影響小,而且可使抗體結(jié)合多個生物素稱為多價制劑。此外,AV或SA具有四個相同亞基,可以同時與多個生物素化抗體即其標(biāo)記物相連接。這種多價放大作用,使BAS有很多靈敏度:②高特異性:AV與生物素的結(jié)合具有高度特異性,且一旦結(jié)合,很難分解,證實這種高穩(wěn)定度的特異結(jié)合,可減少非特異性結(jié)合:③高穩(wěn)定性:AV與生物素間親和常數(shù)約為抗原與抗體間的1-100萬倍,結(jié)合快,不可逆,對各種試劑的環(huán)境因素不敏感,AV與生物素幾何的符合物很穩(wěn)定:④顯像快:注射放射性核素標(biāo)記物后數(shù)小時,就可顯像,從而可以使用短半衰期核素:⑤放射性核素標(biāo)記物在血循環(huán)中滯留時間短,對肝和骨髓損傷小:⑥血中放射性核素標(biāo)記物快速清除,可降低本底,提高T/NT比值;⑦不需要用放射性核素直接標(biāo)記抗體,避免抗體免疫活性受損、
4.RAS預(yù)定位技術(shù)的不足①可能引起免疫反應(yīng):AV和SA與抗體一樣,均為大分子蛋白質(zhì),具有免疫原性。另外,BAS預(yù)定位技術(shù)需多次注射毫克級的量,以致病人有可能產(chǎn)生不同形式的免疫反應(yīng)。目前,對此研究尚不充分,例如,還不清楚人抗SA抗體(HASA)或人抗AV抗體(HAVA)對SA或AV的重復(fù)應(yīng)用和預(yù)定位RII是否有不利影響。有報告認(rèn)為,SA標(biāo)記抗體的免疫原性較單獨SA或McAb為強。AV或SA引起的免疫反應(yīng)的幾率與把他們引入體內(nèi)的途徑、注入數(shù)量和次數(shù)、腫瘤類型和檢測方法的靈敏度等因素有關(guān)。比較起來,注入體內(nèi)時,SA的免疫原性較AV強。目前,正在研究延緩或封閉其免疫反應(yīng)的方法。寄希望于從組DNA技術(shù),應(yīng)用基因工程一體蛋白質(zhì)解決這一問題②內(nèi)源性生物素的可能影響:生物素是體內(nèi)廣泛分布的羧化酶的輔酶。一般注射AV化抗體后,約3天左右才能在注射放射性核素標(biāo)記的生物素,在這段時間內(nèi)與腫瘤結(jié)合的AV化抗體有可能被內(nèi)源性生物素所飽和,而不能在于放射性核素標(biāo)記的生物素結(jié)合,從實際看,內(nèi)源性生物素的影響似乎不是嚴(yán)重的問題。
5.BAS預(yù)定位技術(shù)的研究動向
(1)應(yīng)用AV的“促排”作用 在三步法中,先注射生物素化抗體;在注射AV:最后注射放射性核素標(biāo)記的生物素。在第二部中,AV的中藥作用之一是加速清除在血中的未被腫瘤結(jié)合的生物素化抗體,這就是“促排”作用。AV追擊生物素化抗體的血清作用迅速,一般5-15分鐘,靶/血比值即提高10倍左右。且AV的促排作用與AV的劑量有關(guān)。AV可應(yīng)用一次,也可重復(fù)應(yīng)用,以進(jìn)一步降低血本底放射性。在RIT中采用該法,即可減小中藥臟器受輻射損傷程度,又不會降低治療效果。
(2)在兩步法第二種方法中,因為內(nèi)源性生物素和血中生物素化抗體可與放射性核素標(biāo)記的SA結(jié)合形成復(fù)合物,影響和蘇標(biāo)記SA在目標(biāo)靶聚集。為此有人AV促排法也引入二步法中。具體做法如下:靜脈注射生物素化單抗,御鼎衛(wèi)浴結(jié)腸癌,在腹腔注射AV,最后再靜脈注射放射性核素標(biāo)記的SA。結(jié)果顯示,由于應(yīng)用AV,有效降低了血本底放射性,提高了T/NT比值,又不影響放射性核素標(biāo)記的SA在目標(biāo)靶的聚集。在兩步法中,對AV的注射途徑和計量、生物素化單抗計量及與定位時間等均應(yīng)最佳化,一邊獲得最佳效果。
AV或SA的修飾 AV等電點PH約為10,優(yōu)勢一種堿性糖蛋白,在體內(nèi)非特異結(jié)合較高。標(biāo)記AV注入正常鼠中10分鐘后,肝、腎攝取分別56.6%和28.9%。若將AV的等電點降至7.0-9.3/5.5-6.2/4.0-4.8時,腎臟攝取降低很多,分別降至19.6%、3.1%和1.7%。單肝臟攝取改變不大,這是因為哺乳動物干細(xì)胞上有大量的非唾液酸糖蛋白受體,能與末端有半乳糖殘基(Gal)的糖蛋白分子結(jié)合,于是想到若吧Gal連接到SA上,就能把SA-生物素抗體復(fù)合物結(jié)合到肝細(xì)胞膜,并進(jìn)入溶酶體內(nèi)被消化,以加快其血清除速度。AV去糖化還是其賴氨酸殘基乙酰化,呈中性狀態(tài),可延長其血清除時間。通過對AV和SA修飾,可改進(jìn)BAS預(yù)定位效果。
(3)放射性核素標(biāo)記生物素的制備 三步法中的第三部都是注射放射性核素標(biāo)記生物素或其衍生物。因此第三部用的是通用試劑。高質(zhì)量的通用放射性標(biāo)記化合物的研制非常重要。生物素不能直接用放射性核素標(biāo)記,且對標(biāo)記時的氧化條件要求嚴(yán)格。前以蓄積,生物素結(jié)構(gòu)中的咪唑酮環(huán)是與AV結(jié)合的關(guān)鍵部位,標(biāo)記中必須保持其完整性,生物噻吩環(huán)末端羧基是鏈接外來基團的唯一結(jié)構(gòu)。
(1)碘標(biāo)記 把生物素偶聯(lián)到已碘化的小分子上,例如,先制備1-間碘苯胺(BIA),再用混合肝反應(yīng)把I-BIA接到生物素的羧基上。所合成的這種標(biāo)記生物素,具有完整的咪唑酮環(huán),與SA結(jié)合良好。本標(biāo)記法也適用于其他鹵族放射性核素標(biāo)記生物素。此外,也可先合成生物素酰聚賴氨酸(BIP),這是一小肽類生物素衍生物,再通過這賴氨酸把I標(biāo)在生物素上,實驗表明小肽類可作為標(biāo)記生物素的核素載體。
(2)In和Y標(biāo)記 生物素與金屬配位能力差,中間要通過雙功能配位體乙二胺四乙酸(EDTA)或二乙烯三胺(DTPA)或它們的衍生物等才能把In和Y標(biāo)記到生物素上。有實驗表明,用DTPA作配位體的In標(biāo)記生物素,在正常組織上有非特異性攝取。經(jīng)代謝作用后,游離的In和Y可最終積聚于骨髓。有人研制出一種三價雙功能配位體-去鐵一線脫氨生物素(DACB),這是一種去鐵銨與生物素的衍生物。相比較,去鐵胺與放射性金屬如G和Fe的親和力比轉(zhuǎn)鐵蛋白要高,降低了骨髓攝取。而且,DACB保持了與AV的特一級和能力和在血漿中極好的穩(wěn)定性。
(3)Te標(biāo)記。經(jīng)過丙二胺虧把Tc標(biāo)記在生物素上,在腫瘤BAS預(yù)定位RII中獲得良好效果
(4)Cu標(biāo)記 有人經(jīng)過13N4大環(huán)配體制備出Cu標(biāo)記生物素偶合物。實驗表明,Cu標(biāo)記生物素在體內(nèi)很穩(wěn)定,24小時內(nèi)70%ID經(jīng)腎臟排出。
(5)F標(biāo)記 有人合成了高比活度的F標(biāo)記生物素衍生物,并成功地在動物模型上進(jìn)行了二步法預(yù)定位顯像。在加入Cu標(biāo)記生物素的成功,證明了BAS預(yù)定位技術(shù)可應(yīng)用于PET,這會有效地提高分辨率和靈敏度。
由于McAb分子量大,當(dāng)應(yīng)用于RII和RIT中時存在許多問題,例如,面議原性較強,容易產(chǎn)生HAMA:在血中清除緩慢,T/NT比值小,難以獲得清晰圖像:分子穿透能力小,不易到達(dá)病變部位,不利于顯像和質(zhì)量。所以制備人源抗體和實現(xiàn)抗體小型化成為本領(lǐng)域的兩個核心研究課題。
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