動物細胞培養在單克隆抗體制備中的應用
抗體作為疾病預防、診斷和治療的制劑已有上百年的發展歷史。早期制備抗體的方法是將某些天然抗原經各種途徑面議動物，成熟的B細胞可控受到抗原刺激后，將抗體分泌到血清和體液中。實際上血清中的抗體是多種單克隆抗體的混合物，因此稱之為多克隆抗體。多可控抗體 是人類有目的利用抗體的第一步。多克隆抗體的不均一性，限制了對抗體結構和功能的進一步研究和應用。1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細胞雜交瘤技術制備出均一性的單克隆抗體獲1984年諾貝爾獎。雜交瘤技術的誕生被認為是抗體工程發展的第一次質的飛躍，也是現代生物技術發展的一個里程碑。利用這種技術這杯的單克隆抗體的疾病診斷、治療和科學研究中得到廣泛的應用。抗體所針對的抗原包括半抗原、具有生物活性的天然產物、神經肽、激素、酶和其他蛋白、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、核酸、組織相容性抗原、分化抗原、自身抗原、細胞表面粘附分子等。這些抗原可以來自病毒、支原體、細菌、原蟲、寄生蟲、正常細胞及腫瘤細胞。 雜交瘤抗體技術的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是B淋巴細胞和經抗原免疫的小鼠細胞做小鼠骨髓瘤細胞。B淋巴細胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養基中生長（選擇遠離見后），小鼠骨髓瘤細胞則可在培養條件下無線分裂、增殖、即所謂永生性。在選擇培養基的作用下，只有B瞎報與骨髓瘤細胞融合的雜交才具有持續增殖的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特征的細胞克隆。
細胞的選擇與融合
建立在雜交瘤技術的制備針對抗原特異的單克隆抗體所以融合細胞一方必須選擇經過抗原免疫的B細胞，通常來源于免疫動物的脾細胞。脾是B細胞聚集的中藥場所，無論以何種免疫方式刺激，脾內皆會出現銘心啊的抗體應答反應。融合細胞的另一方則是為了保持細胞融合后細胞的不斷增值，只有腫瘤細胞才具備這種特性。選擇同一體系的細胞可增加融合的成功率。多發性骨髓瘤是B 細胞系惡性腫瘤。所以是理性的脾細胞融合伴侶。目前常用的B細胞瘤株有：P3-X63-Ag8，P3-NSI/1-Ag4-1,X63-Ag8. 563 Sp2/0-Ag14等，這些細胞株皆為HAT敏感細胞株。
使用細胞融合劑造成細胞膜一定程度的損傷，使細胞抑郁相互粘連而融合在一起。最佳的融合效果應是最低程度的細胞損傷而又產生坐高頻率的融合。聚乙二醇是目前最常用的細胞融合劑，一般應用濃度為40%。
細胞融合是一個瑞吉的物理過程。在小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞呵呵細胞懸中，經融合細胞將以多種形式出現。如融合的脾細胞和瘤細胞、融合的細胞和脾細胞、融合的瘤細胞和瘤細胞、未熔合的脾細胞、未熔合的瘤細胞以及細胞的多聚體形式等。正常的脾細胞在培養基中存活僅5-7d，無需特別篩選，細胞的多聚體形式也容易死去。而為融合的瘤細胞則需要驚醒特別的篩選去除
細胞DNA合成一般有兩條途徑。主途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，也算作為重要的輔酶參與這一合成過程。意義輔助途徑是次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經次黃嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶核苷，所以取三者的字頭成為HAT培養基、其中氨甲喋呤是也算的拮抗劑，可阻斷瘤細胞利用正常途徑和成DNA，而融合所用的瘤細胞是經毒性培養基選出的HGPRT細胞株，所以不能再該培養基中生長。因此只有融合細胞具有親代雙方的遺傳性能，可在HAT培養基中長期存活于繁殖。 在動物勉一中，應選用高純度抗原。一種抗原往往有多個決定簇，一個動物在受到抗原刺激后產生的體液免疫應答，實質是眾多B細胞群的抗體分泌。而針對目標抗原表位的B細胞只占極少部分。而且由于細胞融合是隨機的過程，在已經融合的細胞中，有相當比例的無關細胞的融合體，因此需要篩選去除。篩選過程一般分為兩步進行：意識融合稀薄啊的抗體篩選，而是再次基礎上進行的特異性抗體篩選。將融合的細胞驚醒充分稀釋，使分配到培養板的每一孔中的細胞數在0至數個細胞之間（30%的孔為0才能保證每個孔中是單個細胞），培養后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性的細胞；這一過程常被習慣地稱作單克隆。將這些陽性細胞在進行克隆化，應用特異性抗原包被的ELISA找出針對目標抗原的抗體陽性細胞株，增殖后進行凍存、體外培養或動物腹腔接種培養。 單克隆抗體的制備是一個復雜、精細的工藝。為對全過程有一個概括的了解，一般講全過程分為三個階段；免疫小鼠；建立篩選方法和程序；雜交瘤生成。
上圖每一階段都有可能迅速順利完成，單個階段也都有其本身的問題，需要在實驗開始前予以充分考慮，以免影響全局。動物再注入抗原后，一旦出現良好的液體免疫應答，同時又已建立合用的篩選方法，病通過血清對所建立篩選方法進行評價、確定方法后，才可開始雜交瘤細胞的制備。其過程大致為；在細胞融合前數日，用抗原免疫動物；將從免疫動物得到的分泌抗體的細胞與骨髓瘤細胞想混，經行細胞融合（有效地細胞融合約可得1/10
存活的雜交細胞）；其后，將融合細胞用所選擇的培養基限定稀釋，置多空培養板進行培養，在細胞融合后1周，即可對雜交瘤進行測試，從陽性培養孔所取的細胞先增殖，然后，進行單克隆（即但可控生長），雜交瘤的生成與克隆需要時間，很少的實力只需要2個月，有的甚至要1年時間。因制備但可控抗體過程中每一步都對其后各步影響很大，因此均需zhuy8i選擇最適宜的條件，如：要注意抗原的選擇及其性質，如細胞、蛋白質、半抗原等；根據抗原得性質和得量和對抗體得要求等，計劃及建立免疫的途徑和方式；選定抗體篩選的測定方法必須簡單、可重復、特異、并可適用于單克隆抗體的最終適用(即免疫熒光、免疫沉淀、功能試驗等中的應用）要確定細胞培養的條件；細胞融合的方式應考慮雜交方法，細胞的選擇和可控的方式等。
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