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脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)試劑盒說明書5

點擊次數:926 日期:2017/9/6 16:01:10

脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductaseDHAR)試劑盒說明書

 

分光光度法 50 /48

 

注意:正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

 

測定意義:

 

DHAR 存在于細胞質、線粒體和葉綠體中。DHAR 催化 GSH 還原 DHA 生成 AsA  GSSG,調控細胞 AsA/DHA 比值,是抗壞血酸-谷胱甘肽氧化還原循環的關鍵酶。提高植物體內的 DHAR 活性,可提高植物食品中 AsA 含量,進而提高植物食品的營養品質。

 

測定原理:

 

DHAR 催化 GSH 還原 DHA 生成 AsA,通過測定 DHA 減少速率,計算 DHAR 活性。

 

實驗中所需儀器及設備:

 

研缽、冰、低溫離心機、紫外分光光度計、1mL 石英比色皿、可調式移液器和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

 

試劑一:液體 50 mL×1 瓶,4℃保存。

 

試劑二:液體 35 mL×1 瓶,4℃保存。

 

試劑三:粉劑×1 瓶(棕色),4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。

 

試劑四:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。

 

粗酶液提取:

 

1. 按照組織質量(g):試劑一體積(mL) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一)進行冰浴勻漿。8000g4℃離心 10min,取上清置冰上待測。

 

2. 細菌、真菌:按照細胞數量(104 個):試劑一體積(mL)為 500~10001 的比例(建議

 

500 萬細胞加入 1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時間 3min);8000g 4℃離心 20min,取上清液置冰上混勻待測。

 

3. 血清等液體:直接測定。

 

DHAR 測定操作:

 

1. 分光光度計預熱 30 min,調節波長到 265nm,蒸餾水調零。

 

2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預熱 30 min

 

3.  1mL 石英比色皿中依次加入 100μL 上清液100μL 試劑三、100μL 試劑四和 700μL 試劑二,迅速混勻后于 265nm 比色,記錄 30s  150s 的吸光值 A1  A2A=A2-A1

 

DHAR 活性計算公式:

 

(1). 按蛋白濃度計算

 

活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成 1nmol AsA  1 個酶活單位。 DHAR(nmol/min/mg prot) = A÷ε÷d×V 反總×109÷(Cpr×V )÷T

 

= 92×A ÷Cpr

 

(2). 按樣本質量計算

 

活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA  1 個酶活單位。

 

DHAR(nmol/min/g 鮮重) = A÷ε÷d×V 反總×109÷(W×V ÷V 樣總)÷T

 

92×A ÷W

 

(3). 按細胞數量計算

 

活性單位定義:25℃中每 104 個細胞每分鐘還原生成 1nmol AsA  1 個酶活單位。

 

DHAR(nmol/min/104 cell) = A÷ε÷d×V 反總×109÷(細胞數量×V ÷V 樣總)÷T

 

92×A ÷細胞數量

 

4)按液體體積計算

 

活性單位定義:25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA  1 個酶活單位。

DHAR(nmol/min/mL) = A÷ε÷d×V 反總×109÷V ÷T

 

92×A

 

ε AsA  265nm 處摩爾吸光系數為 5.42×104 L/mol /cm109:摩爾分子換算成納摩爾分子;d:比色杯光徑,1 cmV 反總:反應體系總體積,1mL=0.001 LV 樣:反應體系中加入上清液體積,100μL =0.1mLCpr:上清液蛋白濃度,mg/mLV 樣總:加入提取液體積,1mLW,樣本質量,gT:反應時間,2 min

 

注意事項:

 

臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存,3 天內使用完。

 

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