捷世康生物是一家專注于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的“新星”企業(yè),產(chǎn)品及代理品牌產(chǎn)品范圍涵蓋了分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)等生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室消耗品
3重組胰蛋白酶(細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)),9002-07-7
市場(chǎng)價(jià):0
熱賣價(jià):0
點(diǎn)擊次數(shù):998 日期:2017/8/30 16:37:23
單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroasorbate reductase,MDHAR)
試劑盒說(shuō)明書
分光光度法 50 管/48 樣
注意:正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義:
MDHAR 催化 MDHA 還原生成 AsA,在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。
測(cè)定原理:
MDHAR 催化 NADH 還原 MDHA 生成 AsA 和 NAD+,NADH 在 340 nm 有特征吸收峰,但是 NAD+沒有。通過(guò)測(cè)定 340 nm 光吸收下降速率,來(lái)計(jì)算出 MDHAR 活性。
實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備:
研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液槍和雙蒸水試劑組成和配置:
試劑一:液體 50mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:液體 50mL×1 瓶,室溫保存。
試劑三:粉劑×1 瓶(棕色),4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。
試劑四:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。
試劑五:液體 25μL×1 瓶,4℃保存。臨用前加 5mL 試劑二充分溶解。
粗酶液提取:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4℃離心 10min,取上清置冰上待測(cè)。
2. . 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):試劑一體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建
議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時(shí)間 3min);8000g ,4℃離心 20min,取上清液置冰上混勻待測(cè)。
3. 血清等液體:直接測(cè)定。
MDHAR 測(cè)定操作:
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。
3. 依次在比色皿中加入 100μL 試劑三、100μL 試劑四、100μL 試劑五和 600μL 試劑二,最后加入 100μL 上清液,迅速混勻后于 340nm 比色,記錄 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2,
△A=A1-A2。
MDHAR 活性計(jì)算公式:
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
MDHAR 活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×109]÷(Cpr×V 樣)÷T
= 804×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
MDHAR 活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1U。 MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×109]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T
= 804×△A ÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
MDHAR 活性單位定義:25℃中每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。
MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T = 804×△A ÷ 細(xì)胞數(shù)量
(4)按液體體積計(jì)算
MDHAR 活性單位定義:25℃中每毫升液體每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷V 樣)÷T
= 804×△A
ε:NADH 摩爾消光系數(shù),6220 L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V 反總:反應(yīng)體系總體積, 1mL=0.001 L,V 樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,100μL=0.1mL;Cpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定,建議使用本公司蛋白質(zhì)含量 BCA 試劑盒;V 樣總:加入提取液體積,1mL;W,樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,2min。
注意事項(xiàng):
臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存,3 天內(nèi)使用完。
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