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纖維素酶(cellulase,CL)活性測(cè)定試劑盒說明書

點(diǎn)擊次數(shù):867 日期:2017/8/9 16:37:27

 

纖維素酶(cellulaseCL)活性測(cè)定試劑盒說明書

 

分光光度法 50 /24

 

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義:

 

CLEC 3.2.1.4存在于細(xì)菌、真菌和動(dòng)物體內(nèi),能夠催化纖維素降解,是一類可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、棉紡、環(huán)保及可再生資源利用等領(lǐng)域的酶制劑。

 

測(cè)定原理:

 

采用蒽酮比色法測(cè)定CL催化纖維素降解產(chǎn)生的還原糖的含量。

 

需自備的儀器和用品:

 

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、濃硫酸和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

 

提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;

 

試劑一:液體 6mL×1 瓶,4保存;

 

試劑二:液體 40mL×1 瓶,4℃保存;

 

試劑三:粉劑×1 瓶,4保存; 臨用前加入 5mL 蒸餾水和 45mL 濃硫酸充分溶解待用。

 

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備:

 

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~10001 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次); 8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

3、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

 

測(cè)定步驟:

 

1 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 620nm,蒸餾水調(diào)零。

 

2、加樣表(在 EP 管中依次加入下列試劑)

 

試劑名稱

 

對(duì)照管

 

測(cè)定管

         

樣本

 

100

 

100

試劑一(μL

     

180

試劑二(μL

 

740

 

740

蒸餾水(μL

 

360

 

180

37℃振蕩反應(yīng) 1h 后,90℃水浴 15min(蓋緊,防止水分散失),冷卻后

   

8000g 25℃離心 10min,取上清,得糖化液

糖化液 (μL)

350

 

350

試劑三 (μL)

650

 

650

 

混勻, 90℃水浴 10min(蓋緊,防止水分散失),冷卻,620nm 處蒸餾水調(diào)零,測(cè)定吸光值A,計(jì)算 ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

CL 活力計(jì)算:

 

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y = 5.018x - 0.0462x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y 為吸光值。

 

2、血清(漿)CL 活力的計(jì)算

 

單位的定義:每 mL 血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。 CL 活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷V ÷T =39.8×(ΔA+0.0462)

 

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中 CL 活力的計(jì)算

 

1)按照蛋白濃度計(jì)算

 

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。 CL 活力(μg /min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(V ×Cpr) ÷T

 

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷Cpr

 

2)按樣本鮮重計(jì)算

 

單位的定義:每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

 

CL 活力(μg /min /g 鮮重)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(W× V ÷V 樣總) ÷T

 

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷W

 

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

 

單位的定義:每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。 CL 活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(500×V ÷V 樣總) ÷T

 

=0.0796×(ΔA+0.0462)

 

10001mg/mL=1000ug/mLV 反總:反應(yīng)體系總體積,1.2mL V 樣:加入樣本體積,0.1 mLV 樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時(shí)間,60 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。

 

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