過氧化物酶(Peroxidase,POD)試劑盒說明書
微量法 100 管/96 樣
正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義:
POD(EC 1.11.1.7)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物,具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。
測定原理:
POD 催化 H2O2 氧化特定底物,在 470nm 有特征光吸收。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成:
提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:液體 20mL×1 瓶,4℃保存;
試劑二:液體×1 瓶,4℃保存;用時加入 3mL 試劑一充分溶解待用;用不完的試劑 4℃保存;試劑三:液體 3 mL×1 瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次); 8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 470nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 測定前將試劑一、二和三在 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)放置 10min 以上。
3、 樣本測定表
試劑名稱(µL) | 測定孔 |
樣本 | 10 |
蒸餾水 | 60 |
試劑一 | 120 |
試劑二 | 30 |
試劑三 | 30 |
| |
在微量石英比色皿或 96 孔板中按順序加入上述試劑,立即混勻并計時,記錄 470nm 下 30s 時的吸光值 A1 和 1min30s 后的吸光值 A2。計算 ΔA=A2-A1。
注意:
1、若一次性測定樣本較多,可將試劑一、二、三和蒸餾水按比例配成混合液,在 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)放置 10min 以上,測定時加入 10µL 樣本和 240µL 混合液測
定。
2、如果 ΔA 小于 0.005,可將反應(yīng)時間延長到 5min。如果 ΔA 大于 0.5,可將樣本用提取液稀釋后測定,計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
POD 活性計算:
用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、血清(漿)POD 活性
單位定義:每 mL 血清(漿)在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個酶活力單位。
計算公式:
POD(U/mL)=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T =2500×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 POD 活性
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位定義:每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個酶活力單位。POD(U/mg prot)=ΔA×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷0.01÷T =2500×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算
單位定義:每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個酶活力單位。POD(U/g 鮮重)=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =2500×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位定義:每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個酶活力單位。
POD(U/104 cell)=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =5×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.25mL; V 樣:加入樣本體積,0.01mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。
用 96 孔板測定的計算公式如下
1、血清(漿)POD 活性
單位定義:每 mL 血清(漿)在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 為一個酶活力單位。
POD(U/mL)=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.005÷T =5000×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 POD 活性
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位定義:每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 為一個酶活力單位。POD(U/mg prot)=ΔA×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷0.005÷T =5000×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算
單位定義:每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 為一個酶活力單位。POD(U/g 鮮重)=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =5000×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位定義:每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 為一個酶活力單位。
POD(U/104 cell)=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =10×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.25mL; V 樣:加入樣本體積,0.01mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。
原創(chuàng)作者:青島捷世康生物科技有限公司