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過氧化氫含量(H2O2)試劑盒說明書

點擊次數:1313 日期:2016/9/12 8:50:44

過氧化氫含量(H2O2)試劑盒說明書
 
分光光度法 50 管/48 樣
 
測定意義:
 
H2O2 是生物體內最常見的活性氧分子,主要由 SOD  XOD 等催化產生,由 CAT  POD 等催化降解。H2O2 不僅是重要的活性氧之一,也是活性氧相互轉化的樞紐。一方面,H2O2可以直接或間接地氧化細胞內核酸,蛋白質等生物大分子,并使細胞膜遭受損害,從而加速細胞的衰老和解體;另一方面 H2O2 也是許多氧化應急反應中的關鍵調節因子,。
測定原理:
 
H2O2 與硫酸鈦生成黃色的過氧化鈦復合物,在 415nm 有特征吸收。
 
需自備的儀器和用品:
 
可見分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1 mL 玻璃比色皿、丙酮 60mL、濃鹽酸 10mL、研缽和冰。
 
試劑的組成和配制:
 
試劑一:丙酮 60mL×1 瓶,4℃保存;(自備)
 
試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存;臨用前加入 10mL 濃鹽酸充分溶解備用。用不完的試劑 4℃ 保存;試劑三:15mL×1 瓶,4℃保存;
 
試劑四:60mL×1 瓶,4℃保存;
 
H2O2 提取:
 
1、細菌或細胞樣品的制備:收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104 個):

試劑一體積(
mL)為 500~10001 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 試劑一),超聲波破碎細菌或
細胞(冰浴,功率
20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次);用試劑一定容至 1mL8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
 
2. 組織樣品的制備:按照組織質量(g):試劑一體積(mL) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一)進行冰浴勻漿;轉移至 EP 管中,用試劑一定容至 1mL8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)樣品:直接檢測。
 
測定步驟
 
1、分光光度計預熱 30min 以上,調節波長至 415nm,蒸餾水調零。
 
2、將試劑二、三和四 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)水浴 10min 以上。
 
3、 EP 管中按順序加入下列試劑
 
試劑名稱(μL
 
測定管
 
對照管
 
 
 
 
 
樣本
 
吸取的量的為全部上清液
 
 
 
 
 
 
 
試劑一
 
 
 
1000
 
 
 
 
 
試劑二
 
100
 
100
 
 
 
 
 
試劑三
 
200
 
200
 
 
 
 
 
 
4000g,常溫離心 10min,棄上清,留沉淀
 
 
 
 
 
試劑四
 
1000
 
1000
 
 
 
 
 
 
加入試劑四溶解沉淀后,室溫靜置 5min,倒入比色皿中,測定 415nm 處吸光值 A。對照管只要做一次即可。計算ΔAA 測定-A 對照。
注意事項:
 
1、由于試劑一易揮發,試劑一必須先預冷再加,研磨時必須在冰上研磨。
 
2、本試劑盒中試劑的揮發性較高,請帶一次性手套和口罩。
 
H2O2 含量計算:
 
1、標準條件下測定的回歸曲線, y = 0.062x - 0.08(x 為標準品濃度,μmol/mLy ΔA)
 
2、血清(漿)中 H2O2 含量的計算:
 
H2O2 含量(μmol/mL)=(ΔA0.08)÷0.062=16.13×(ΔA0.08)
 
3、細菌、細胞或動物組織中 H2O2 含量計算(1)按照蛋白濃度計算
H2O2 含量(μmol/mg prot)=[(ΔA0.08) ÷0.062×V1]÷(V1×Cpr)=16.13×(ΔA0.08) ÷Cpr
 
需要另外測定,建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。(2)按照樣本質量計算
H2O2 含量(μmol/g 鮮重)=[(ΔA0.08) ÷0.062×V1]÷(W ×V1÷V2)=16.13×(ΔA0.08) ÷W
 
(3 ) 按照細菌或細胞密度計算:
 
H2O2 含量(μmol/104)=[(ΔA0.08) ÷0.062×V1]÷(500×V1÷V2)=0.032×(ΔA0.08) V1:加入反應體系中樣本體

積,
1mLV2:加入提取液體積,1mLCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細胞或細菌

總數,
500 萬。

原創作者:青島捷世康生物科技有限公司

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