以DNA和RNA的體外操作為核心而建立的一系列旨在研究基因結構、基因表達及其調控的實驗技術及相關理論，統(tǒng)稱為分子生物學技術。其中最突出的是創(chuàng)立于20世紀70年代的DNA重組技術。這項技術已成為人類解碼自身及生物界生命本質和主動改變生物遺傳性狀的有力工具，并以此衍生出不少新技術。
第一節(jié)DNA重組技術
DNA重組技術是運用多種限制性內切酪和DNA連接曲等，在細胞外將一種外源基因DNA(來自原核或真核生物)和或體DNA入連接重組．形成雜交DNA。再將雜交DNA轉入宿主生物(如大腸桿菌)，使外源基因DNA在宿主生物細胞中隨著生物細胞的繁殖而增殖或表達，最終獲得外源基因的表達產物或改變生物原省的遺傳性狀。
這項技術是把DNA作為組件，按生物規(guī)律，人為設計來實現(xiàn)體外基因的改造，使生物的遺傳性狀獲得改變，故稱為“遺傳工程”(genetic emgomeeomg)。基本質是基因的體外重組，所以又稱“基因工程”(gene engineering)或“DNA重組技術”(recombinant DNA techniques）、“分子克隆”(mo1ecular cloning)等。
第一例DNA重組是1973年加利福尼亞大學的H.Boyer教授與斯坦福大學的S.Cohen教授
共同將pSC101質粒DNA與另一種抗卡那霉素的質粒DNA進行體外重組，雜交的DNA轉人大腸桿菌，結果細菌表達出了雙親DNA的遺傳信息，即同時抗四環(huán)索和抗卡那霉親，說明外源基因得到了表達。DNA重組技術的成功說明：
①不同來源、無關的基因在實驗室中可以按人的愿望進行重組構建。
②重組的外源基因引入另一種生物細胞后，可以保持其原有的遺傳性狀，在新的環(huán)境中被
增殖、轉錄和翻譯，并可使宿注的遺傳性狀按照設計的路線發(fā)生永久性的改變。
長期以來，人類在認識和改變生物的遺傳特性力面做了大量的研究工作，期待有一天能按人的意愿來改變生物的遺傳性能，獲得預想的結果。現(xiàn)在用DNA重組技術終于實現(xiàn)了這一意愿。這是20世紀生命科學上的重大進展．它促進了生命科學理論的發(fā)展，也對改善人類生活做出了重大的貢獻。
這項技術既運用了前人的多項實驗技術，包括DNA和RNA的分離制備、基因的分離、核
苷酸的順序分析以及分子雜交方法等，同時也促進PCR技術、轉基因技術、克隆技術及以定
點突變技術為基礎的“蛋白質工程”等新技術的產生。可以說，DNA重組技術深入到生物科學
的方方面面，成為當今生物科學工作者必備的基本知識與技能。
一、DNA重組技術的基礎
DNA重組技術的出現(xiàn)不是偶然的，是前人多項實驗技術積累的結果。
1．核酸的制備
20世紀60年代以來，生物化學實驗技術包括電泳、層析、電鏡、同位素和超離心等技術及儀器設備的不斷發(fā)展與創(chuàng)新，為DNA重組技術的產生提供了重要的手段。DNA和RNA的分離制備就是一個例子。20世紀40年代以前，要想從生活的細胞中制備出比較完整的DNA和RNA供體外研究是很困難的，因為缺乏必要的手段來防止DNA制備過程中脫氧核糖核酸酶(DNase)的陣解作用及操作中剪切力的破壞。在找到檸檬酸、EDTA等金屬絡合劑和十二烷基硫酸鈉(SDS)、酚、尿素、焦碳酸二乙酪等蛋白變性劑之后，這些試劑有力地抑制了DNase的活力；另
外，低溫高速離心機以及新的層析方法的運用，使制備分子比較完整的DNA成為可能。現(xiàn)在已能從動物組織、植物組織、細菌及病毒巾制得比較完整的DNA分子。然而，在制備過程中由于操作、振蕩等產生的剪切力對DNA，尤其是高等生物的染色體基因組DNA分子仍有破壞作用，使共總會遭到剪切，故獲得完整的DNA分子仍是不容易的。
RNA的分子比DNA小，極易遭到核糖核酸酶(RNsae)的降解。RNase十分穩(wěn)定，不易被
破壞，且具有驚人的活力，如加熱至蛋白質變性的溫度(90℃）其活力也不完全喪失。RNase分布極廣，不僅存在于細胞內也分布在環(huán)境中，包括于和器皿上。如不小心，RNA極易被降解。近年來經過技術改進．已經能制得各種RNA，尤其是mRNA。
一般講，從細胞中獲得的DNA、RNA純品，其化學性質是穩(wěn)定的，只要貯存條件得當，可以保存很長時間。這為DNA、RNA在體外進行各種研究提供了可能性。
此外，核醒含量的測定、同位素標記、分子雜交以及DNA和RNA的核苷酸順序測定等技術的產生與發(fā)展．為在體外分析和鑒定核酸提供了重要的檢測手段。
2．限制性內切酶
DNA重組是指在實驗室將兩種DNA分子經過切割，選擇適合的片段連接起來的過程。這一步是在限制性內切酶發(fā)現(xiàn)以后才實現(xiàn)的。
20世紀50午代，有人在實驗中曾經發(fā)現(xiàn)同一種噬茵體分別與兩種細鹵培養(yǎng)，噬茵體只在一種細菌中成活，而杯另一種中絕大多數(shù)不能成活，這表明這個菌株對入侵的噬菌體具有限制性用。1962年、Arber等人經過多次實驗終于證明：細菌中存在有兩種酶，一種是限制性內切酶，可以將外源DNA切割降解；另一種是修飾酶也稱甲基化酶，能使DNA中的核苷酸甲基化，使之不受限制性酶的降解。兩種酶可對同一DNA序列作用。細菌借助這兩種酶，將自身的DNA進行甲基化修飾使之不受限制性內切酶的降解，而對外來的、未甲基化的DNA則進行降解，以保認細菌自身的DNA不受外來DNA的干擾，保持其遺傳性狀的穩(wěn)定性。這兩種酶在體內組成一個系統(tǒng)，稱限制／修飾系統(tǒng)(restriction-modification system)。
以后從細菌中分別分離出了I型和II型兩類限制性內切酶。I型能識別DNA分子內非甲基化的特定序列，但切割是隨機的．見切割位點遠離識別位點，不能生成特定片段。II型是1970年Smith第一次從流感嗜血桿菌中分離到的，它能識別雙鏈DNA分子中特定的序列，大部分具有二倍對稱性(回文結構)。
對稱軸位于中間AT堿基對之間，箭頭和星號分別表示酶切位置及甲基化位置。II型限制性內切酶識別的DNA序列一般長度4、5和6個堿基對。限制性內切酶切割DYA的方式有：
1、從識別序列的中間切開，產生平齊末端(blunt ends)。如HaeIII。
2、在識別序列對稱軸的左邊(3′→5′鏈)和右邊(3′→5′鏈)進行切割，形成帶有凸出的；—磷酸苯閉的戳件人端(cohesivend)。
3、介識別序列對稱獨的右邊(5’一3’鏈)和對稱軸左邊(3’—k5’鏈)切開，形成帶有凸出的3′-羥基的黏性末端(c)。
黏性末端只要用同一個酶切割的DNA片段退火即可連接，因為黏性末端互補的。平齊末端則需要另一DNA片段也修飾成平齊末端方可連接。
已知的限制性內切酶已達千余種。在了解各種限制性內切酶“切割”特點的基礎上．巧妙利用互相的關系，即可將DHA分子按人的愿望切剖成人小不同的片段，供DNA重組運用。限制性內切酶有如一把“生物于術刀”，為DNA重組技術提供了有力的工具。
限制性內切酶都來自各種細茵，它們的命名是用細菌屬名的第一個字母〔大寫)和種名的前兩個字母(小寫)構成酶的基本名稱。若酶是從—種特殊菌株來的，在基本名稱后再加上該菌株的名稱符號。名稱后的羅馬數(shù)字，表示在該特殊菌株中發(fā)現(xiàn)此酶的先后次序。如Hae II是從(H aernophilus aegypticus)中提取的，并且是從中發(fā)現(xiàn)的第二個酶。
限制性內切酶切割成的DNA片段，重組鏈接時由DNA鏈接酶催化進行。
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