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流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史

點(diǎn)擊次數(shù):1424 日期:2016/3/17 13:29:55

  流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry, 簡(jiǎn)稱FCM)是對(duì)細(xì)胞貨細(xì)胞器快讀測(cè)量的高技術(shù)。依賴測(cè)量的參數(shù),還可以用物理的方法將一個(gè)群體中的亞群分選出來(lái),這就是流式細(xì)胞分選術(shù)。上述的“流式”,指的是在測(cè)量過(guò)程中細(xì)胞是流動(dòng)的,不是靜止的,這是與在此前對(duì)細(xì)胞測(cè)量技術(shù)的最大差異之處。流式細(xì)胞書目前在國(guó)外的一些有關(guān)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)院已發(fā)展成常規(guī)技術(shù),在我國(guó)經(jīng)過(guò)十年的推廣也逐漸普及。經(jīng)過(guò)數(shù)十年的努力,流式細(xì)胞術(shù)從一個(gè)只能計(jì)數(shù),稍后可測(cè)粒子大小的一起,發(fā)展到今天可快速測(cè)定同一個(gè)細(xì)胞的多種化學(xué)和物理的特性,這中間凝集這許多人的心血,既有成功也是失敗。
   第一個(gè)報(bào)道自動(dòng)計(jì)數(shù)細(xì)胞的是Moldavan(1934年),他描述了一個(gè)裝置:懸浮的紅細(xì)胞或是用中性紅染色的酵母,在顯微鏡的載物臺(tái)上從一個(gè)毛細(xì)玻璃管中流過(guò),每個(gè)通過(guò)的細(xì)胞可別一個(gè)光電裝置記錄下來(lái)。他注意到了一系列技術(shù)上的細(xì)節(jié)。但此后一直沒(méi)有進(jìn)一步的報(bào)道。現(xiàn)在,人們把這個(gè)實(shí)驗(yàn)看成是有關(guān)流式細(xì)胞術(shù)的第一個(gè)嘗試。1941年,Kie-lland申請(qǐng)了一個(gè)專利,大體上與Moldavan差不多,沒(méi)有什么更新的內(nèi)容。
通過(guò)這些實(shí)驗(yàn),人們發(fā)現(xiàn),在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞要流過(guò)的狹窄管道中存在的最大問(wèn)題是大細(xì)胞貨細(xì)胞團(tuán)阻塞通道,為解決這個(gè)困境,人們不禁想起1883年和Reynolds用來(lái)研究管子中層流時(shí)使用的鞘液原理。Guker等人在1947年就是用這個(gè)原理個(gè)光電技術(shù)結(jié)合起來(lái)對(duì)氣溶膠中的粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)。隨后。Grosland-Taylor利用同一原理在1953年設(shè)計(jì)了一個(gè)流動(dòng)室,用光學(xué)方法來(lái)計(jì)數(shù)血細(xì)胞。他讓懸浮的細(xì)胞慢慢地注入快速流動(dòng)的液柱中,這個(gè)液柱外面被層流鞘液包圍著,粒子在軸心流動(dòng)。這樣做有兩個(gè)好處:一是消除了大個(gè)顆粒阻塞現(xiàn)象;二是它可精確控制粒子進(jìn)入液柱的位置,使之在軸心上,這樣就建立了流體動(dòng)力聚焦的原理。今天,幾乎所有的流式細(xì)胞術(shù)的液流原理都擦私用了上述技術(shù)。
1949年,Wallance Coulter申請(qǐng)了一個(gè)名叫“流動(dòng)的懸浮粒子技術(shù)方法”的專利,在專利的方法中,他使粒子通過(guò)一個(gè)小孔。只要粒子與懸浮的介質(zhì)間在電導(dǎo)率上有差異,小孔中粒子的存在與否即能引起可檢測(cè)出的電特性變化,此現(xiàn)象通常被稱為Coulter效應(yīng),他在次基礎(chǔ)上生產(chǎn)了Coulter計(jì)數(shù)器(1956年)此后還有一些人發(fā)展了各種粒子測(cè)量設(shè)備,但原理都差不多。其中Parker和Horst在1953年申請(qǐng)的專利“同時(shí)計(jì)數(shù)紅白細(xì)胞的方法”,是用稀釋的血細(xì)胞懸浮在等滲液中,白細(xì)胞變成藍(lán)色,紅細(xì)胞認(rèn)為紅色。細(xì)胞通過(guò)一根導(dǎo)管再被一束光照射,透射光被分成紅、藍(lán)兩個(gè)成分病分別送到光電池上,這樣就可紀(jì)錄通過(guò)的細(xì)胞是吸收了藍(lán)光還是紅光。于是不上單紀(jì)錄了通過(guò)的細(xì)胞數(shù)目,還識(shí)別了通過(guò)的細(xì)胞是白細(xì)胞還是紅細(xì)胞,這已經(jīng)有點(diǎn)今日流式細(xì)胞術(shù)的意思了。此后,知道60年代中期,流式細(xì)胞術(shù)始終無(wú)多大進(jìn)展.紅細(xì)胞稀釋液。
1965年,Kamentsky提出兩個(gè)新概念:意識(shí)用分光光度學(xué)定量測(cè)量細(xì)胞組分;另一個(gè)是細(xì)胞的不同組分可以被同時(shí)多參數(shù)測(cè)量,用以給細(xì)胞分類。最初曾用核算的紫外吸收和可見(jiàn)光散射兩個(gè)參數(shù)同事測(cè)量未染色的細(xì)胞,測(cè)量的速度大約是每秒測(cè)50個(gè)細(xì)胞。他同時(shí)也是第一個(gè)用兩維直方圖顯示并分析多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)的人。他也是第一個(gè)用計(jì)算機(jī)接口到儀器上,記錄并分析多參數(shù)數(shù)據(jù)的人。他的這個(gè)裝置隨后改裝成商品儀器,商品名為Ortho Cytograph和Cytofluorograph.
1968年,Dittrich和Gohde在英國(guó)申請(qǐng)了一個(gè)專利,名稱是“在分散體系中自動(dòng)測(cè)量和計(jì)數(shù)粒子的裝置”。他們?cè)跍y(cè)量粒子的熒光或磷光時(shí),讓粒子平行于透鏡光軸的方向運(yùn)動(dòng),并通過(guò)大數(shù)值孔徑物鏡的焦面,粒子通過(guò)焦面后再用一個(gè)沖洗液使之偏轉(zhuǎn)。該裝置使用了Kohler照明,因而在粒子運(yùn)動(dòng)的出口處可得到均勻的照明,這就免去了聚焦的問(wèn)題。這樣一個(gè)設(shè)備可以用Kohler照明進(jìn)行熒光的激發(fā),也可以手機(jī)發(fā)散的熒光,光源使用氙燈或高壓汞燈。采用大的數(shù)值孔徑透鏡保證了激發(fā)光和收集發(fā)射光都有大的立體角,而較大的立體角又可在測(cè)量非對(duì)稱細(xì)胞時(shí)細(xì)胞不同的取向不致使信號(hào)發(fā)生變化。Gohde以很小的變異系數(shù)測(cè)量了細(xì)胞群體的DNA。按上述原理制成的商品名稱為Phywe Impulscytophotometer簡(jiǎn)稱ICP,隨后生產(chǎn)的ICP22,直到今天還有人仍在使用。
 在1967年,Van Dilla和Los Alamos小組率先發(fā)展了一種液流束、照明光軸,檢測(cè)系統(tǒng)光軸三者互相垂直的流式細(xì)胞計(jì)。這種不依賴顯微鏡的設(shè)備采用了由Crosland-Taylor設(shè)計(jì)的層流流動(dòng)室并使用氬離子激光器為照明光源。這種垂直相交的系統(tǒng)以后更進(jìn)一步發(fā)展,除了可測(cè)熒光外還可測(cè)量散射光,后來(lái)還把Coullter計(jì)數(shù)器也安裝進(jìn)去。他們第一個(gè)用熒光Feulgen反應(yīng)對(duì)細(xì)胞DNA染色,展示了DNA倍性和熒光間的線性關(guān)系,他們的DNA直方圖第一個(gè)清楚的顯示出細(xì)胞周期的G1時(shí)相、S時(shí)相,G2和M時(shí)相。他們第一個(gè)用同步培養(yǎng)的細(xì)胞論述了定量細(xì)胞動(dòng)力學(xué),而Gohde和Dittrich則是第一個(gè)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量DNA以確定細(xì)胞周期變化來(lái)研究藥物影響細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)的人。
至于歷史細(xì)胞分選術(shù),則首先是由Fulwyler在1965提出的,其改進(jìn)型是在1969年。他使用了Sweet在1965年使用的一個(gè)靜電墨水噴射液偏轉(zhuǎn)技術(shù)。這個(gè)技術(shù)原來(lái)裝在Coulter計(jì)數(shù)器上可使細(xì)胞按體積大小分類。與此同時(shí),也是在1965年,Kamentsky獨(dú)立地申請(qǐng)了一個(gè)專利,這是一個(gè)在液流中經(jīng)過(guò)光度學(xué)貨電學(xué)測(cè)量后分選細(xì)胞的方法。在此方法中利用了氣體動(dòng)力學(xué)、水力學(xué)和靜電學(xué)的技術(shù)。后來(lái)Friedman曾設(shè)計(jì)過(guò)一個(gè)用液流開(kāi)關(guān)分選的裝置,但較少使用,直到今天分選用的大部分仍然是電子學(xué)的方法,如Becton Dickinson公司的各種課供使用的FACS儀器仍然在應(yīng)用液滴偏轉(zhuǎn)的原理。
http://www.dlzgs.cn/products/d18.html

原創(chuàng)作者:青島捷世康生物科技有限公司

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