影響紙片擴散法藥敏實驗結果的因素及其常見誤差的原因

    1959年Kirby-Bower用試管法和紙片法檢查 2000余株葡萄球菌，發現試管法測出的抗菌藥物的MIC與紙片法測出的菌株環直徑密切相關，并在此基礎上制定捷世其結果的標準表。

1972年美國食品與藥品管理委員（FDA）和國家臨床實驗室標準委員會（NCCIS）推薦紙片法擴散試驗作為藥敏的常規方法，主要用于需氧菌及生長快的兼性需氧管。

在紙片擴散的過程中，同時存在細菌生長和抗菌素擴散形成的梯度濃度兩種力量之間的對抗，兩種力量可收到不同因素的影響，必須認識這些因素，并加以控制，才能保證結果的正確。

影響紙片藥敏試驗結果的因素

1、培養基 應不含看菌藥物及拮抗物質，蛋白胨中含氨基苯磺酸可使磺胺嘧啶中和，含葉酸代謝產物可使TMP作用時效。不含蛋白胨的牛肉浸液瓊脂平皿可獲得大二清晰的抑菌環，無胨牛肉浸液瓊脂加入溶解的人血、馬血或兔血則可使抑菌換更清晰。

對培養基的成分和鹽類的濃度應保持相對穩定，不應任意改變，如綠膿桿菌對青大霉素的敏感試驗受鈣、鎂離子的影響很大，Mueller-Hinton瓊脂，基本上不含拮抗物質，食欲大多數病原菌生長。

培養基的厚度應為4mm，抑菌環薄大而厚小，平皿應放平澆注、平皿直徑應為9-10cm，澆注培養基應為25毫升。瓊脂的濃度一般應為1.3-1.7%核實，對抑菌環無影。PH應為7.2-7.4，偏酸偏堿對抗菌素的抑菌環物影響。培養基不應加單糖類以免產酸。培養基保存在2-3℃可用一周，成分濃縮，硬度增加等，均不利于細菌生長和擴散，培養基應等滲，對營養要求高的細菌，如鏈球菌、肺炎鏈球菌可加入5%羊、兔血等脫纖維血。

2、倍檢菌種量的因素 是中藥的影響因素之一。細菌接種量大，抑菌環小，菌量過少，抑菌環相對增大，Waterwrth建議，近融合、半融合生長為宜，被檢菌稀釋濃度的簡易方法有三種；

(1)浸沒法（Flooding法） 取菌落在2毫升蛋白胨水中制成懸液，加在另一支2毫升蛋白胨水中混勻，用滴管吸取菌浸沒培養基，再將多余的菌懸液吸出。

（2）涂抹法（Barry 氏方法之一） 挑取被檢菌菌落，轉入無菌肉湯35-37℃培養4-6小時（或轉大量菌懸液不孵育），菌液相當K-B濁度管0.5號濃度，肉眼比濁，菌液制備15分鐘后用拭子浸沾菌液，將多余的菌液在試管上擠去，然后在平皿旋轉60度角涂三次。

（3）重層法（Barry方法之二）挑取被檢菌落4-5個轉入0.5毫升腦心浸液肉湯中，于35-37℃，孵育4-5小時，達到/ml，可保持數小時穩定，用標準接種環，挑取1微升加入9毫升并冷至50℃的1.5%瓊脂MH培養基中，充分混合，重層于已備好的直徑15cm藥敏試驗用MH瓶培養基表面，若為9cm培養皿需含菌瓊脂2毫升。

上訴各種發放均需開蓋，室溫無菌放置10-15分鐘使水蒸發后貼紙片。

藥敏紙片的因素

1、為對藥敏實驗的質量控制，應由檢驗中心統一制備紙片，用標準菌株做重復性實驗，各紙片抑菌環直徑相差不應＞1-1.5mm，紙片應含等量定量的藥物，冷風吹干，不要在37℃溫箱中烘干，以免有些青霉素敏感度下降。

2、紙片藥物的含量對藥敏結果的影響，紙片藥物的含量是根據常規投藥量和該藥物的MIC來確定的，最是含量，能使不同敏感度的菌株抑菌環明顯區分開，一般可按權威單位的推薦含量及出售廠商指定含量，根據MIC或服藥后血清殺菌試劑或許晴含藥濃度。

3、紙片保存不當的影響，一般保存一個月以上（密閉），可由不同程度的下降，低溫干燥條件下4℃缸內保存時間長，取出后1小時貼上，開蓋過早，空氣中水蒸氣進入收場音響藥敏。

下圖為粘質沙雷氏菌對青霉素G0.00020ug/ml敏感變化情況，在37℃培養實驗中，80%相對溫度條件下30天后，幾乎完全失效。

（4）藥敏紙片的貼附、孵育時間和判斷時間不當對藥敏實驗的影響，在9cm平皿培養基上貼7張，紙片間距＞1.5cm，兩片中心相聚＞24mm。貼后不移動，15分鐘后放入35-37溫箱中18-24小時判讀結果。

     抑菌環一SIR為分界點，國內不論藥物種類或被檢菌相同與否，以抑菌環直徑＞15mm為敏感（s），10-15mm中毒敏感（I)，＜10mm為耐藥（R)。

除上述的各項影響因素進行質控，應嚴格遵守執行外，還要注意下列幾個問題。

1、抗菌素的選擇，應曬糧選定集中，按檢查的菌種而取首選藥物，如有耐藥則另換，因為存在價差耐藥為題，每類抗菌應選一種為代表，使臨床醫師有所了解。

2、紙片擴散使用于生長快的細菌，18-24小時孵育做終點讀取結果，生長慢的細菌如甲型溶血性鏈球菌等應超過24小時觀察結果。

3、報告方式；應報告敏感和耐藥的抗菌藥物，供臨床醫師選用，有敏感的抗菌藥物，即不應寶中毒敏感的抗菌藥物，中毒可做緩沖地帶以減少藥敏實驗的誤差。

4、紙片擴散一般應用平皿固體MH培養基，鏈球菌、腸球菌需加血，流感嗜血桿菌需用巧克力培養基。

5、不能再CO2環境中孵育，以免使瓊脂表面PH受影響(PH降低）。

擴散試驗誤差的原因

實驗條件和技術上的誤差，對藥敏實驗的準確性影響很大，并且一種誤差可能包含另一種誤差，下面是遇到過的一些原因：

1、沒使用MH培養基。

2、MH培養基制備不當，特別是PH調整不準。

3、使用過期和不當儲存的培養基。

4、藥敏紙片制作或保存不當。

5、菌液濃度不準。

6、比濁管制備和儲存不當和過久。

7、接種時棉拭中過多的菌液沒壓出。

8、未及時將細菌接種于培養基平皿上。

9、接種后沒及時貼附藥敏紙片。

10、貼敷后沒及時孵育。

11、唯獨偏離35℃或大氣中CO2含量過高。

12、時間不粗18-24小時，提前讀取結果。

13、抑菌環量取不準確。

14、接種培養物使混合菌。

15、接種培養物使生長慢的細菌或厭氧菌，。

16、沒有質控標準菌株對照。

17、沒能正確的將被建軍抑菌環轉換為相應的S、I、R.

原創作者：青島捷世康生物科技有限公司