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谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)說明書

點(diǎn)擊次數(shù):1322 日期:2017/8/14 14:45:33

谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)說明書
 
分光光度法 50 /48
 
注意:正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
 
測(cè)定意義:
 
GR 是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶,是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶之一(通常昆蟲中 GR  TrxR 取代)。GR 催化 NADPH 還原 GSSG 生成 GSH,有助于維持體內(nèi) GSH/GSSG 比值。GR 在氧化脅迫反應(yīng)中對(duì)活性氧清除起關(guān)鍵作用,此外 GR 還參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)途徑。
 
測(cè)定原理:
 
GR 能催化 NADPH 還原 GSSG 再生 GSH,同時(shí) NADPH 脫氫生成 NADP+;NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰,相反 NADP+在該波長無吸收峰;通過測(cè)定 340 nm 吸光度下降速率來測(cè)
 
定 NADPH 脫氫速率,從而計(jì)算 GR 活性。
 
自備儀器和用品:
 
紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、移液器、1mL 石英比色皿和蒸餾水
 
試劑組成和配置:
 
試劑一:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。
 
試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加入 5.0 mL 蒸餾水,混勻。
 
試劑三:液體 3mL×1 支,4℃保存。
 
粗酶液提取:
 
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g4℃離心 15min,取上清,置冰上待測(cè)。
 
2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~10001 的比例(建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時(shí)間 3min);然后 8000g4℃,離心 15min,取上清置于冰上待測(cè)。
 
3. 血清等液體:直接測(cè)定。
 
操作步驟:
 
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min,調(diào)節(jié)波長到 340 nm,蒸餾水調(diào)零。
 
2. 試劑一置于 25℃(普通物質(zhì))或者 37℃(哺乳動(dòng)物)中預(yù)熱 30min
 
3. 測(cè)定管:取 1mL 石英比色皿,依次加入 50μL 試劑三,100μL 試劑二, 750μL 試劑一,
 
100μL 上清液迅速混勻, 340nm 測(cè)定 10 s  190 s 吸光度,記為 A 測(cè) 1  A 測(cè) 2,△A
 
測(cè)定管= A 測(cè) 1A 測(cè) 2(注意加完上清液后迅速混勻測(cè)定)
 
計(jì)算公式:
 
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
 
活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0 條件下,每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。
GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A 測(cè)定管÷ε÷d×V 反總×109]÷[Cpr×V 樣]÷T
= 536×A 測(cè)定管÷Cpr
 
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
 
活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0 條件下,每克樣本每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為
 
個(gè)酶活單位。
 
GR 酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ A 測(cè)定管÷ε÷d×V 反總×109] ÷(W×V ÷V 樣總)÷T = 536×A 測(cè)定管÷W
 
(3) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0 條件下,每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。
GR 酶活(nmol/min/104 cell)= [ A 測(cè)定管÷ε÷d×V 反總×109] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V ÷V 樣總)÷T
 
536×A 測(cè)定管÷細(xì)胞數(shù)量
 
4)按液體體積計(jì)算
 
活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0 條件下,每毫升液體每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。
GR 酶活(nmol/min/mL)= [ △A 測(cè)定管÷ε÷d×V 反總×109]÷×V 樣÷T
= 536×A 測(cè)定管
 
εNADPH 摩爾消光系數(shù) 6.22×103L/mol/cmV 反總:反應(yīng)體系總體積,1000μL=0.001 L
 
106:1 mol=1×106μmol; Cpr:上清液蛋白濃度(mg/mL);V 樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,100μL =0.1 mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;W,樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,
 
min
 
注意事項(xiàng):
 
1)樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行,且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力,勻漿液避免反復(fù)凍融;(2)試劑二須現(xiàn)配現(xiàn)用,配制完后,置于冰上,未使用完的 4℃保存,三天內(nèi)使用完。(3測(cè)定前須先用 12 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),哺乳動(dòng)物組織一般須用試劑一稀釋 25 倍。
 
4)細(xì)胞中 GR 活性測(cè)定時(shí),細(xì)胞數(shù)目須在 300 -500 萬之間,細(xì)胞中 GR 的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理,不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞

原創(chuàng)作者:青島捷世康生物科技有限公司

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